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檢測原理

試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 。往預(yù)先包被病毒抗ti的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測抗原,經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在suan的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450NM波長下測定吸光度(OD值) ,與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中豬病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液: 3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn) 離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20°C, 避免反

復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.酶標(biāo)儀(450NM)

2.高精度加樣器及槍頭: 0.5-10UL、 2-20UL、 20-200UL、 200-1000UL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8°C,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶完quan溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

3.預(yù)處理后的樣本請按照操作步驟用樣ben稀釋ye適當(dāng)稀釋以達(dá)到試劑盒的檢測效果。.

4.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

常用方法:

1. 夾心法:

夾心法常用于檢測大分子抗原,一般的操作步驟為:

a. 將具有專一性的抗ti固著(coating)于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體,檢體中若含有待測的抗原,則其會與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié)

c. 洗去多余待測檢體,加入另一種對抗原專一的一次抗ti,與待測抗原進(jìn)行鍵結(jié)

d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗ti,加入帶有酶的二次抗ti,與一次抗ti鍵結(jié)

e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗ti,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果

原理:針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標(biāo)抗ti,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。

2. 間接法

間接法常用于檢測抗ti,一般的操作步驟為:

a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余的抗原。

b. 加入待測檢體,檢體中若含有待測的一次抗ti,則其會與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)。

c. 洗去多余待測檢體,加入帶有酶的二次抗ti,與待測的一次抗ti鍵結(jié)。

d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗ti,加入酶底物使酶呈色,藉儀器(ELISA reader)測定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評估有色終產(chǎn)物的含量即可 測量待測抗ti的含量。

原理:利用酶標(biāo)記的抗抗ti以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗ti。

3. 競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機(jī)制,一般用于檢測小分子抗原,其操作步驟為:

a. 將具有專一性的抗ti固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體,使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié)

c. 加入帶有酶的抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié),由于塑膠孔盤上固著的抗ti數(shù)量有限,因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗ti就越少,亦即,兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗ti鍵結(jié),即所謂競爭法之由來。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,當(dāng)檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少,顯色也就越淺。

e. 當(dāng)需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原,或是不易得到足夠的純化抗ti以固著于孔盤上時,一般會考慮使用競爭法ELISA。

免責(zé)聲明:

1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產(chǎn)生的一切后果,由實驗者承擔(dān),本公司概不負(fù)責(zé)。

2. 嚴(yán)格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔(dān)。

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